一、DNA片段的互補(bǔ)黏性末端連接

對(duì)于具有互補(bǔ)黏性末端的DNA片段，連接反應(yīng)主要依賴DNA連接酶的催化。例如，E.coli DNA連接酶以及廣泛應(yīng)用的T4 DNA連接酶。當(dāng)兩個(gè)DNA片段的末端由同一種限制性內(nèi)切核酸酶切割時(shí)，連接后仍保留原有的識(shí)別序列。但如果使用兩種同尾酶切割產(chǎn)生的互補(bǔ)黏性末端，雖然可以有效連接，但重組的DNA分子通常會(huì)失去這兩種酶的識(shí)別序列。

二、DNA平末端片段的連接

平末端DNA片段的連接則主要依賴T4 DNA連接酶。只要兩個(gè)DNA片段的末端是平末端，無(wú)論是由何種限制性內(nèi)切核酸酶切割還是通過(guò)其他方法產(chǎn)生，都可以進(jìn)行有效連接。若使用兩種不同限制性內(nèi)切核酸酶切割產(chǎn)生的平末端DNA片段進(jìn)行連接，連接后的DNA分子會(huì)失去這兩種酶的識(shí)別序列。而如果使用同一種限制性內(nèi)切核酸酶切割產(chǎn)生的平末端DNA片段，連接后的DNA分子將保留該酶的識(shí)別序列，有時(shí)甚至?xí)霈F(xiàn)新的限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別序列。

三、DNA片段末端的修飾與連接

當(dāng)待連接的DNA片段末端不是互補(bǔ)黏性末端或平末端時(shí)，需要進(jìn)行末端修飾。這通常通過(guò)核酸外切酶將黏性末端修飾成平末端，或使用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶修飾平末端成互補(bǔ)黏性末端。有時(shí)為了避免DNA片段自行連接成環(huán)形或二聚體，會(huì)使用堿性膦酸酯酶修飾其中一種DNA片段的5′-P為-OH。

四、添加連桿后的DNA連接

對(duì)于既無(wú)互補(bǔ)黏性末端又無(wú)平末端的兩種DNA片段，除了上述的末端修飾連接方法外，還可以通過(guò)人工合成的連桿或銜接頭進(jìn)行連接。先將連桿連接到待連接的DNA片段末端，然后使用合適的限制性內(nèi)切核酸酶切割連桿，使待連接的DNA片段具有互補(bǔ)黏性末端，最后在DNA連接酶的催化下進(jìn)行連接。也可以根據(jù)DNA片段的末端選擇合適的銜接頭直接進(jìn)行連接。

以下是關(guān)于兩種主要DNA連接酶的介紹：

1. E.coli DNA連接酶：此酶來(lái)自大腸桿菌，具有催化DNA基本骨架磷酸二酯鍵形成的功能。它主要連接具有相同黏性末端的DNA分子，對(duì)平末端的效果則不佳。

2. T4 DNA連接酶：這是一種單鏈多肽酶，分子量為68,000道爾頓。它能在正常條件下催化雙鏈DNA上相鄰的3′羥基和5′磷酸末斷形成磷酸二脂鍵。

在粘性末端DNA片段的連接中，DNA連接酶能夠催化外源DNA和載體分子之間的連接作用，形成重組的DNA分子。而平末端DNA片段的常用連接方法包括同聚物加尾法、銜接物連接法及接頭連接法等。

以上內(nèi)容僅供參考，如需更多信息，建議查閱生物化學(xué)相關(guān)書籍或咨詢生物學(xué)專家獲取。您好，

（1）E·coli DNA連接酶，來(lái)源于大腸桿菌，可用于連接粘性末端；

（2）T4DNA連接酶：來(lái)源于T4噬菌體，可用于連接粘性末端和平末端，但連接效率低。

（3）熱穩(wěn)定的DNA連接酶（thermostableDNAligase），是從嗜熱高溫放線菌（Thermoactinomycesthermophilus）菌株中分離純化的，一種能夠在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接作用的一種核酸酶。